Muchos de nosotros hemos acabado con un HPLC entre las manos a lo largo de nuestra carrera profesional. La primera vez que te encuentras frente a uno, con un montón de módulos y sin saber qué hace cada uno, es bastante frustrante. Así que hoy voy a repasar de manera muy rápida los diferentes componentes que tienen los aparatos de cromatografía de líquidos (tanto HPLC como UPLC) y ver para qué sirve cada uno, si son imprescindibles, etc. Empezamos:
Esquema básico
Lo que necesita mínimamente un HPLC es lo necesario para pasar un líquido por un tubo y algo que pueda medir el analito a la salida.
Lo primero necesitamos un recipiente donde tener la fase móvil para ir cogiendo poco a poco. Usualmente se suelen usar frascos ISO de vidrio aunque se puede tener un contenedor más grande. Debe ser inerte a la fase móvil (no soltar nada ni disolverse en la fase móvil) y si puede ser tapado mucho mejor.
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| Frasco ISO https://www.auxilab.es/es/productos-laboratorio/frasco-iso-tapon-azul-1000-ml-simax/ |
A continuación hay que llevar ese líquido a hacia la siguiente etapa, la bomba que va a impulsar ese líquido a través de nuestro sistema. Lo llevaremos a través de tubos inertes, habitualmente plásticos y (semi)transparentes, para saber por dónde va el líquido en el caso de los primeros llenados, aunque también pueden ser opacos. En la punta del tubo suele haber una frita metálica para filtrar la fase móvil (que ya debería estar previamente filtrada) y así evitar que partículas sólidas puedan atascar o deteriorar nuestro sistema.
A continuación, y antes de la bomba pueden localizarse dos dispositivos, el mezclador y el desgasificador. El mezclador permite mezclar en las proporciones deseadas los líquidos que llegan por dos o más canales. Esto permite hacer optimizaciones más rápidas y hacer GRADIENTES de fase móvil, una ventaja muy grande en cromatografía que permite obtener los picos con una elución más temprana y con menor dispersión que en cromatografía isocrática. Los mezcladores colocados antes de la bomba se denominan de "baja presión" ya que mezclan los líquidos sin presión. Este punto es importante con respecto a los mezcladores de "alta presión", colocados después de la bomba, ya que al tener los líquidos diferentes coeficientes de compresión (normalmente uno acuoso y otro orgánico) las proporciones al mezclarlo antes o después de la bomba varían.
El desgasificador es un artilugio opcional (aunque muy recomendable) y que ya la mayoría de los aparatos comerciales nuevos traen incluido. Sirve, como su nombre indica, para eliminar el posible aire o gas que haya disuelto o libre en la fase móvil. Todo el aire disuelto así como las burbujas son como veneno para el HPLC ya que, en primer lugar, al llegar a la bomba y ésta hacer presión, es más fácil comprimir ese gas hasta hacerlo mínimo que bombear el líquido por los tubos, por lo que los caudales serán irregulares, entrecortados y poco reproducibles. Además, este gas puede producir caminos preferentes en nuestra columna, haciendo que la retención sea menor y la eficacia de la columna disminuya mucho. Por último, este gas dará señales que pueden ser confundidas con picos en el detector, o al menos, estropearnos el cromatograma con señales fantasma provenientes de este ruido. En caso de no tener desgasificador, la solución ideal es burbujear en la fase móvil un gas inerte (Ar o He de alta pureza) que arrastre por nucleación ese gas disuelto. En caso de no ser posible, ya que es una opción cara, es imprescindible filtrar diariamente la fase móvil a vacío (idealmente con un filtro de 0.45 micras para HPLC y 0.22 micras para UPLC) para asegurarnos que al pasar por el filtro el gas queda eliminado, así como trasvasarlo con cuidado de no crear burbujas, vamos, que no lo tireis de muy alto, estas llenando un bote, no escanciando sidra.
A continuación llega la primera parte imprescindible, principal e ineludible de un sistema HPLC, la BOMBA. Son bombas de pistones (normalmente dos) accionadas por motores eléctricos de pasos y que permiten un control preciso de la presión y del volumen impulsado. Los sistemas HPLC trabajan habitualmente en el orden de 1 mL/min, aproximadamente mientras que los UPLC se encuentran en el intervalo de decenas de microlitros por minutos. También se comercializan bombas que pueden trabajar en modo de HPLC y UPLC simplemente ajustando electrónicamente los caudales. Además, suelen llevar válvulas antirretorno para evitar bombear en el sentido equivocado así como pequeños filtros por si se rompiesen las fritas de la fase móvil.
Ahora ya tenemos la fase móvil a presión y hay que mandarla por tubos que aguanten esa presión y sean inertes. Estos materiales suelen ser acero inoxidable o PEEK (Polieteretercetona), que aguantan bien la presión con pequeños grosores. El diámetro interno de estos tubos es mínimo, apenas visible, de unas pocas micras, por lo que el corte y manipulación de estos tubos es crítica, ya que el aplastar estos tubos supone cerrar el tubo y evitar que circule el líquido. Existen tenazas especiales para cortar estos tubos así que cuidado con cortarlos con cuchillas, tijeras, etc, ya que puede ser un atasco muy fácil y casi imperceptible.
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| Errores típicos en los tubos de HPLC https://www.chromacademy.com/chromatography-troubleshooting-HPLC-variable-peak-height.html |
Ya tenemos el líquido circulando, ahora hay que meter la muestra. Ya que el líquido circula a presión el abrir el tubo para meter la muestra no es recomendable por lo que se suelen emplear válvulas de presión. Las habituales son las de 6 vías (en más del 90% de los equipos) aunque hay hasta de 16 válvulas que permiten una tremenda versatilidad a cambio de mayor complejidad y dinero. La introducción de las muestras en los inyectores se puede hacer manualmente con una jeringa o automáticamente con un automuestreador y una gradilla con las distintas muestras. Al inyectar el líquido en estas válvulas se suele llenar un bucle de tubo de la válvula (entre 5-50 microlitros, aunque pueden llegar a un mililitro) para asegurar inyecciones reproducibles.
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| GIF de funcionamiento de una válvula de 6 vías (en inglés) https://people.uwplatt.edu/~sundin/351/351hHPLC.htm |
Ya, una vez la muestra introducida a presión en el sistema llegamos a la columna, donde vamos a separarlo. Este punto, junto con la composición de la fase móvil, son los parámetros claves de la separación y deben ser elegidos para cada grupo de analitos. Como único dato, decir que las partículas de las columnas de HPLC suelen tener un tamaño entre 5-3 micras de diámetro mientras que las de UPLC suelen ser su-2 micras, habitualmente 1.7 micras. Debido a su menor tamaño, tienen mucha más superficie, lo que aumenta su capacidad de separar así como la presión necesaria para hacer pasar el líquido entre sus partículas, ya que ocupan mayor sección del tubo ( es como intentar llenar el suelo de balones de fútbol o naranjas, estás últimas dejan huecos más pequeños que hace que sea más difícil de pasar el líquido por ahí).
De la columna saldrá otro tubo (con poca presión) que dirigirá el líquido hacia el detector, de los que ya hemos hablado en otro post, y, si es necesario, al desecho. En todos estos recorridos hay que intentar que los tubos de unión sean lo más cortos posibles, evitando los volúmenes muertos y las juntas defectuosas que puedan tener pérdidas o entre aire.
Es posible realizar derivatizaciones pre-columna y post-columna para mejorar la separación y detección, respectivamente. También pueden intercalarse antes del detector columnas supresoras de iones en cromatografía iónica. Estos elementos, aunque muy minoritarios, no son extraños y pueden aparecer en ciertas aplicaciones. Hay que tenerlos siempre en cuenta si son necesarios.
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| Esquema básico de un sistema HPLC Tesis doctoral de Miguel Peñín Ibáñez |
Y con esto os dejo hasta la semana que viene. Como siempre, dudas, consultas, ampliaciones de cualquier tema tocado o que os interese, puedes preguntar por aquí o en la página de Facebook del blog. Allí también se pondrá la encuesta para elegir temas que desarrollar aquí, así que no te olvides de visitarla con frecuencia.
Nos vemos la semana que viene!
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