¿Qué es la PCR?
Las siglas PCR significan "Polimerase Chain Reaction" (Reacción en cadena de la polimerasa) y no "Proteína C Reactiva" como se ha comentado en alguna rueda de prensa. La PCR se basa en replicar un número muy grande de veces una cadena de ADN obtenida, de manera que se obtienen miles o millones de copias de una sola cadena de ADN. Esto permite detectar con una sensibilidad mucho mayor una secuencia concreta de ADN presente en una muestra.Si somos rigurosos, en esta pandemia no se ha empleado la PCR como tal, sino una variante, la RT-PCR. Estas RT que se ponen delante implican un paso previo de Transcripción Inversa (Reverse Transcription en inglés), que implica un paso previo al proceso de la PCR. El coronavirus no posee ADN, sino ARN, que inyecta para infectar las células. Este ARN es más frágil y más reactivo que el ADN aunque su estructa es muy similar, por eso se transcribe la secuencia de ARN a ADN para poder replicarla.
¿Qué se necesita para una PCR?
Después de tomar la muestra, es necesario extraer el ADN (o ARN) del interior de las células por lo que se utilizan surfactantes para poder disolver la pared celular. Una vez aislado y precipitado el ADN (o ARN en el caso de los virus) se añade una disolución, normalmente de un kit, donde ya vienen todos los componentes necesarios para realizar la PCR. En estos kits se incluyen las polimerasas, las bases nucleicas trifosfato, cebadores (cadenas que inician la reacción), sales de magnesio y potasio (cofactores para la polimerización) y un tampón que regula el pH de la reacción para que se pueda llevar a cabo. Todos estos componentes en un volumen entre 15-100 µl se introducen en un eppendorf.Tras esto se lleva a cabo la multiplicación del ADN. Para ello, es necesario un termociclador, un aparato que calienta y enfría en ciclos la muestra. Estos cambios de temperatura son debidos a las distintas etapas de las que consta una PCR. En una PCR normal se realizan entre 20 a 35 ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. Un termociclador normal puede realizar los ciclos en casi un centenar de muestras simultáneamente.
 |
| Termociclador MasterCycler Pro S Fuente: Wikipedia; GFJ / CC BY-SA (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0) |
La polimerasa que se usa actualmente es una polimerasa de un organismo termófilo, que puede funcionar a temperaturas muy altas, permitiendo acortar el tiempo de cada ciclo al no necesitar que se enfríe para realizar la polimerización. La polimerasa más empleada es la polimerasa Taq.
Finalmente, hay que poder analizar los fragmentos multiplicados. Usualmente se usaban geles de agarosa o acrilamida para realizar electroforesis en gel pero actualmente lo más utilizado es la electroforesis capilar. Para que se puedan identificar en la electroforesis capilar hay 2 opciones principales: la adición de una fracción de nucleótidos con marcadores fluorescentes, normalmente en las posiciones de polimerización y con un color diferente para cada base, de manera que se formen cadenas de distinta longitud en las que cada longitud emita en el color correspondiente a la posición de la base, pudiéndose leer la secuencia de bases en colores.
 |
| Lectura de un electroferograma para la secuenciación de ADN Fuente: Wikipedia; CNX OpenStax / CC BY (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0) |
La otra opción de detección es emplear un detector de masas en tándem, de manera que tras sucesivos fraccionamientos estos coincidan con los de un patrón introducido previamente. También es posible la secuenciación de la cadena de ADN por masas pero es un proceso más complicado y, normalmente, es necesario la ayuda de software que ayude a compilar la gran cantidad de información.
Siento la parrafada sobre la detección, pero creo que es la parte más limitante con respecto al tiempo de la PCR y una de las más olvidadas cuando se habla de PCR. Además, el hecho de ser experto en análisis hace que sea la parte en la que más puedo aportar... Seguimos...
¿Qué etapas tienen los ciclos de la PCR?
La PCR tiene etapas de temperatura en el termociclador que permiten la amplificación o multiplicación de las cadenas de ADN. Recordemos que las cadenas de ADN son dobles, que están unidas por uniones intermoleculares (enlaces de hidrógeno) y que para decirle dónde vamos a empezar la multiplicación vamos a usar los cebadores.Inicio
Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 98 °C (si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto solo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.
Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento la forma más habitual. Otros métodos serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.
Alineamiento o unión del cebador
A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos, permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) solo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.
Extensión o elongación de la cadena
Actúa la polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo las bases complementarias. La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos (para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C aunque se suele usar 72 °C).
El tiempo de extensión depende tanto del ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.
Elongación final
Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.
Conservación
Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo.
Aquí acabaría el ciclo de PCR, que para realizar el siguiente ciclo volvería a empezar. Cada uno de estos ciclos se pueden llevar a cabo en casi un centenar de viales simultáneamente.
Como conclusión, la PCR es una técnica muy potente en el campo de la genética y la genómica que permite la replicación de una cadena de ADN millones de veces, siendo capaces de mejorar la sensibilidad de las técnicas de detección y pudiendo obtener millones de copias a partir de una sola hebra de ADN (para 20 ciclos salen 1.048.576 copias y para 35 ciclos 34.359.738.368 copias de la cadena original). Además, en el caso de los virus y, en particular, del coronavirus, es necesario el uso de una transcripción inversa, que pase el ARN presente en el virus a ADN, necesario para la PCR. Finalmente, todas las copias obtenidas se analizan por electroforesis en gel o capilar. La similitud o diferencia con la secuencia ya conocida del coronavirus determinan si la muestra obtenida contiene o no algún resto del virus.
Hasta aquí el post de esta semana. Espero que te haya gustado, y más después de ser uno de los temas más elegidos en las encuestas semanales en Facebook y Twitter. Recuerda que tú puedes elegir el siguiente tema en las encuestas semanales. Para ello, síguenos en nuestras redes sociales: en Facebook, Twitter e Instagram con @callofchemistry .
Nos vemos!!