Cromatografía de gases (GC): Principios y comparación con HPLC

Buenas! Es este blog hemos hablado mucho de cromatografía líquida pero muy poco de cromatografía de gases. Los principios fisicoquímicos de separación son los mismos pero la instrumentación e interacciones son ligeramente diferentes. Empezamos...

¿Qué es la cromatografía de gases?

Como ya hemos explicado en muchos post anteriormente, la cromatografía es una técnica de separación basada en la diferente afinidad de un compuesto por dos fases, una estacionaria y otra móvil que circula por su superficie. La principal diferencia de la cromatografía de gases radica en que la fase móvil es un gas, frente a la cromatografía de líquidos que la fase móvil es un líquido (muy obvio).

Debido a que es un gas, las interacciones con el analito son mínimas, de hecho se intenta que sean nulas, y que únicamente sea soluble porque los gases tienden a mezclarse. Por tanto. esta fase móvil no interaccionante se va a denominar "gas portador" ya que únicamente transporta la muestra sin interaccionar con ella. Esta es una de las grandes diferencias con la cromatografía de líquidos y que permite que los picos sean mucho más estrechos (aunque esto ya lo explicaré otro dia con más detalle, lo podéis sugerir en los comentarios). Los gases portadores más empleados son el N₂ y el He, aunque en casos  especiales se puede emplear H₂, aunque hay que tener cuidado con la mala costumbre que tiene de explotar al estar en contacto con el aire (como a la salida de la columna), a presión y a temperaturas altas (más de 200ºC), por eso no se usa tanto.

Otra de las principales diferencias está en el tipo de columnas. En cromatografía de gases se suelen usar columnas capilares muy largas (entre 20 y 50 metros). Si comparamos este tipo de columnas con las utilizadas en los cromatografos de líquidos más modernos (UPLC) se ve que la tendencia es totalmente opuesta, el empleo de columnas rellenas y de longitudes mínimas (de aproximadamente 5 cm). Esta gran diferencia se basa en las propiedades físicas de los gases, principalmente en su viscosidad y su difusividad, que permiten que el flujo de los gases a través de espacios pequeños sea más fácil y que las moléculas les cueste menos moverse.

¿Qué diferencias principales hay en la instrumentación?

Supongo que esta pregunta que en principio puede parecer bastante trivial, ya que la manera de trabajar con un líquido o un gas son relativamente obvias, hay otros muchos aspectos que no lo son tanto y vamos a ver los más importantes.

El primero es que para impulsar un líquido a través de un espacio muy pequeño (como el que queda entre las partículas del relleno de la columna) hace falta una presión enorme, por lo que la bomba es una de las partes más importante. Por contra, los gases suelen venderse comercialmente a presión, haciendo que la bomba sea poco útil, ya que esta presión es más que suficiente para hacer que el gas circule.

La segunda es la manera de introducir la muestra. En líquidos vimos que esto se hace a través de válvulas de presión que permiten introducir líquidos a presión ambiental en sistemas a alta presión debido a la mínima compresibilidad de los líquidos. Como en los gases no es así, las inyecciones se realizan en un pequeño volumen a alta temperatura, para que si se introduce un liquido volátil se produzca una evaporación instantánea (evaporación flash) y que los gases que se puedan inyectar calientes no condensen. Además muchos inyectores pueden realizar diluciones mediante los sistemas split, que separan parte de la inyección e inyectan el resto, pudiéndose realizar inyecciones reproducibles con relaciones 1:1000 (uno se inyecta 1000 se desechan).

La última radica en la manera de realizar los gradientes. En cromatografía líquida se realizan incrementando la proporción de modificador orgánico, no siendo posible esto en gases porque el gas ni siquiera interacciona con el analito. Este gradiente se realiza con la temperatura de la columna, estimándose que la retención se reduce a la mitad cada 30ºC, así que con una diferencia de temperatura progresiva (rampa) entre dos temperaturas muy diferentes (habitualmente casi 200ºC) pueden separarse compuestos muy diversos.


Este post ya está quedando bastante largo, por lo que hoy lo vamos a dejar aquí. Si queréis alguna aclaración, duda, ampliar contenido o cualquier otra cosa lo podéis hacer en los comentarios de abajo, en Facebook o en Instagram (ambos @callofchemistry).

Nos vemos la semana que viene!!

¿Qué partes tiene un HPLC?

Muchos de nosotros hemos acabado con un HPLC entre las manos a lo largo de nuestra carrera profesional. La primera vez que te encuentras frente a uno, con un montón de módulos y sin saber qué hace cada uno, es bastante frustrante. Así que hoy voy a repasar de manera muy rápida los diferentes componentes que tienen los aparatos de cromatografía de líquidos (tanto HPLC como UPLC) y ver para qué sirve cada uno, si son imprescindibles, etc. Empezamos:

Esquema básico

Lo que necesita mínimamente un HPLC es lo necesario para pasar un líquido por un tubo y algo que pueda medir el analito a la salida.

Lo primero necesitamos un recipiente donde tener la fase móvil para ir cogiendo poco a poco. Usualmente se suelen usar frascos ISO de vidrio aunque se puede tener un contenedor más grande. Debe ser inerte a la fase móvil (no soltar nada ni disolverse en la fase móvil) y si puede ser tapado mucho mejor.

Frasco ISO
https://www.auxilab.es/es/productos-laboratorio/frasco-iso-tapon-azul-1000-ml-simax/

A continuación hay que llevar ese líquido a hacia la siguiente etapa, la bomba que va a impulsar ese líquido a través de nuestro sistema. Lo llevaremos a través de tubos inertes, habitualmente plásticos y (semi)transparentes, para saber por dónde va el líquido en el caso de los primeros llenados, aunque también pueden ser opacos. En la punta del tubo suele haber una frita metálica para filtrar la fase móvil (que ya debería estar previamente filtrada) y así evitar que partículas sólidas puedan atascar o deteriorar nuestro sistema.

A continuación, y antes de la bomba pueden localizarse dos dispositivos, el mezclador y el desgasificador. El mezclador permite mezclar en las proporciones deseadas los líquidos que llegan por dos o más canales. Esto permite hacer optimizaciones más rápidas y hacer GRADIENTES de fase móvil, una ventaja muy grande en cromatografía que permite obtener los picos con una elución más temprana y con menor dispersión que en cromatografía isocrática. Los mezcladores colocados antes de la bomba se denominan de "baja presión" ya que mezclan los líquidos sin presión. Este punto es importante con respecto a los mezcladores de "alta presión", colocados después de la bomba, ya que al tener los líquidos diferentes coeficientes de compresión (normalmente uno acuoso y otro orgánico) las proporciones al mezclarlo antes o después de la bomba varían.

El desgasificador es un artilugio opcional (aunque muy recomendable) y que ya la mayoría de los aparatos comerciales nuevos traen incluido. Sirve, como su nombre indica, para eliminar el posible aire o gas que haya disuelto o libre en la fase móvil. Todo el aire disuelto así como las burbujas son como veneno para el HPLC ya que, en primer lugar, al llegar a la bomba y ésta hacer presión, es más fácil comprimir ese gas hasta hacerlo mínimo que bombear el líquido por los tubos, por lo que los caudales serán irregulares, entrecortados y poco reproducibles. Además, este gas puede producir caminos preferentes en nuestra columna, haciendo que la retención sea menor y la eficacia de la columna disminuya mucho. Por último, este gas dará señales que pueden ser confundidas con picos en el detector, o al menos, estropearnos el cromatograma con señales fantasma provenientes de este ruido. En caso de no tener desgasificador, la solución ideal es burbujear en la fase móvil un gas inerte (Ar o He de alta pureza) que arrastre por nucleación ese gas disuelto. En caso de no ser posible, ya que es una opción cara, es imprescindible filtrar diariamente la fase móvil a vacío (idealmente con un filtro de 0.45 micras para HPLC y 0.22 micras para UPLC) para asegurarnos que al pasar por el filtro el gas queda eliminado, así como trasvasarlo con cuidado de no crear burbujas, vamos, que no lo tireis de muy alto, estas llenando un bote, no escanciando sidra.

A continuación llega la primera parte imprescindible, principal e ineludible de un sistema HPLC, la BOMBA. Son bombas de pistones (normalmente dos) accionadas por motores eléctricos de pasos y que permiten un control preciso de la presión y del volumen impulsado. Los sistemas HPLC trabajan habitualmente en el orden de 1 mL/min, aproximadamente mientras que los UPLC se encuentran en el intervalo de decenas de microlitros por minutos. También se comercializan bombas que pueden trabajar en modo de HPLC y UPLC simplemente ajustando electrónicamente los caudales. Además, suelen llevar válvulas antirretorno para evitar bombear en el sentido equivocado así como pequeños filtros por si se rompiesen las fritas de la fase móvil.

Ahora ya tenemos la fase móvil a presión y hay que mandarla por tubos que aguanten esa presión y sean inertes. Estos materiales suelen ser acero inoxidable o PEEK (Polieteretercetona), que aguantan bien la presión con pequeños grosores. El diámetro interno de estos tubos es mínimo, apenas visible, de unas pocas micras, por lo que el corte y manipulación de estos tubos es crítica, ya que el aplastar estos tubos supone cerrar el tubo y evitar que circule el líquido. Existen tenazas especiales para cortar estos tubos así que cuidado con cortarlos con cuchillas, tijeras, etc, ya que puede ser un atasco muy fácil y casi imperceptible.

Errores típicos en los tubos de HPLC
https://www.chromacademy.com/chromatography-troubleshooting-HPLC-variable-peak-height.html

Ya tenemos el líquido circulando, ahora hay que meter la muestra. Ya que el líquido circula a presión el abrir el tubo para meter la muestra no es recomendable por lo que se suelen emplear válvulas de presión. Las habituales son las de 6 vías (en más del 90% de los equipos) aunque hay hasta de 16 válvulas que permiten una tremenda versatilidad a cambio de mayor complejidad y dinero. La introducción de las muestras en los inyectores se puede hacer manualmente con una jeringa o automáticamente con un automuestreador y una gradilla con las distintas muestras. Al inyectar el líquido en estas válvulas se suele llenar un bucle de tubo de la válvula (entre 5-50 microlitros, aunque pueden llegar a un mililitro) para asegurar inyecciones reproducibles.

GIF de funcionamiento de una válvula de 6 vías (en inglés)
https://people.uwplatt.edu/~sundin/351/351hHPLC.htm

Ya, una vez la muestra introducida a presión en el sistema llegamos a la columna, donde vamos a separarlo. Este punto, junto con la composición de la fase móvil, son los parámetros claves de la separación y deben ser elegidos para cada grupo de analitos. Como único dato, decir que las partículas de las columnas de HPLC suelen tener un tamaño entre 5-3 micras de diámetro mientras que las de UPLC suelen ser su-2 micras, habitualmente 1.7 micras. Debido a su menor tamaño, tienen mucha más superficie, lo que aumenta su capacidad de separar así como la presión necesaria para hacer pasar el líquido entre sus partículas, ya que ocupan mayor sección del tubo ( es como intentar llenar el suelo de balones de fútbol o naranjas, estás últimas dejan huecos más pequeños que hace que sea más difícil de pasar el líquido por ahí).

De la columna saldrá otro tubo (con poca presión) que dirigirá el líquido hacia el detector, de los que ya hemos hablado en otro post, y, si es necesario, al desecho. En todos estos recorridos hay que intentar que los tubos de unión sean lo más cortos posibles, evitando los volúmenes muertos y las juntas defectuosas que puedan tener pérdidas o entre aire.

Es posible realizar derivatizaciones pre-columna y post-columna para mejorar la separación y detección, respectivamente. También pueden intercalarse antes del detector columnas supresoras de iones en cromatografía iónica. Estos elementos, aunque muy minoritarios, no son extraños y pueden aparecer en ciertas aplicaciones. Hay que tenerlos siempre en cuenta si son necesarios.

Esquema básico de un sistema HPLC
Tesis doctoral de Miguel Peñín Ibáñez

Y con esto os dejo hasta la semana que viene. Como siempre, dudas, consultas, ampliaciones de cualquier tema tocado o que os interese, puedes preguntar por aquí o en la página de Facebook del blog. Allí también se pondrá la encuesta para elegir temas que desarrollar aquí, así que no te olvides de visitarla con frecuencia.

Nos vemos la semana que viene!

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