¿Cómo optimizar con el mínimo número de ensayos?

Muchas veces queremos obtener las mejores condiciones para realizar nuestro experimento, las cantidades precisas, proporciones exactas o valores óptimos de cualquier cosa que se os ocurra. Muchas veces con un par de ensayo del factor más importante es suficiente y conocemos el valor deseado pero... ¿Y si tenemos muchos factores? ¿Y si la variación de la respuesta depende de la proporción de varios factores a la vez? ¿Y si los valores óptimos de varias respuestas no coinciden? ¿Y si quiero obtener una superficie de respuesta para saber dentro de que intervalos me puedo mover al realizar mis experimentos?

No te preocupes, hoy voy a intentar ayudarte con todo esto ayudándome de las matemáticas y la estadística, utilizando algunos ejemplos de mi propia tesis doctoral. Vamos...

¿Qué es la Quimiometría?

Según la IUPAC en su Gold Book, la quimiometría es la aplicación de la estadística para el análisis de datos químicos (de química orgánica, analítica o médica), el diseño de experimentos químicos y de simulaciones. Hoy me voy a centrar en el diseño de experimentos y cómo hacerlo con el mínimo número de experimentos.

La metodología más empleada es la basada en diseños factoriales aunque hay otras metodologías como el simplex que, en algunos casos, pueden obtener resultados similares con un menor número de experimentos. La desventaja del simplex frente a los diseños es que no se conoce la influencia de cada una de las variables, sus interacciones ni el número total de experimentos a realizar a priori.

El objetivo de un diseño factorial es estudiar el efecto de varios factores sobre una o varias respuestas, cuando se tiene el mismo interés sobre todos los factores. Por ejemplo, uno de los objetivos particulares más importantes que en ocasiones tiene un diseño factorial es determinar una combinación de niveles de los factores en la que el desempeño del proceso sea mejor.

Los factores pueden ser de tipo cualitativo (máquinas, tipos de material, operador, la presencia o ausencia de una operación previa, etc.), o de tipo cuantitativo (temperatura, humedad, velocidad, presión, etc.). Para estudiar la manera en que influye cada factor sobre la variable de respuesta es necesario elegir al menos dos niveles de prueba para cada uno de ellos. Con el diseño factorial completo se ensayar aleatoriamente todas las posibles combinaciones que pueden formarse con los niveles de los factores a investigar.

Los diseños factoriales se denominan de acuerdo al número de ensayos que se realizan en cada variable. Si suponemos un diseño de dos variables, una con dos y otra con tres ensayos de cada variable o niveles, tendríamos un cuadrado con dos puntos (en los extremos) en dos de los lados y los otros dos con tres, resultando un total de 2×3=6 puntos del diseño factorial. Habitualmente, se suele emplear el mismo número de experimentos en todas las variables, resultando diseños del tipo 3×3 o 2×2×2, resultando diseños tipo 3² o 2³, o n^v, donde n es el número de niveles y v el número de variables.

De igual manera, es habitual normalizar los valores de las variables aunque en la mayoría de los casos no es necesario. Para normalizar, se le otorga al punto menor el valor de -1 mientras que al mayor se le asigna 1. El resto de los puntos se asignan proporcionalmente a esta diferencia. Por ejemplo, si hay un punto central, este punto tendrá el valor de 0.

Una vez tenemos esto, en teoría podríamos preparar diseños factoriales con muchas variables y muchos puntos por variable, estamos únicamente limitados por nuestra capacidad de realizar tantos experimentos, ya que crecen exponencialmente. Muchas veces los experimentos resultantes son demasiados para realizarlos en una única jornada de trabajo o, incluso, en dos. Para evitar estos trastornos existen los diseños factoriales fraccionados, en los que únicamente se ensaya una fracción de los puntos, resultando una reducción muy importante de ensayos (en un factor de 1/2^p). Estos diseños se expresan como n^v-p, siendo p la fracción de puntos no ensayados que acabo de comentar. Por ejemplo, en un diseño 2^3-1 únicamente se ensayan (2×2×2)/2= 4 puntos de los 8 originales de los que cuenta el diseño. Además de una reducción de los experimentos muy importante también hay información que se pierde por el camino, en este caso, hay interacciones que se vuelven indistinguibles. Vamos a verlo con un ejemplo concreto de mi tesis doctoral.

Para optimizar una separación quiral de tres profenos ensayé cuatro variables (pH, porcentaje de 2-propanol (2-PrOH) y concentración de sales de la disolución reguladora de pH (Tampón) y de trietilamina (TEA), un modificador para el reconocimiento quiral) para determinar cuáles eran las más influyentes en mi respuesta, resultando 2⁴=16 fases móviles a ensayar en un día, cosa bastante complicado, por lo que decidí usar un diseño factorial fraccionado. Para evaluar los resultados utilicé 7 respuestas. La matriz de datos obtenida fue la siguiente:

Matriz de diseño factorial fraccionado

En la parte inferior de la tabla se pueden ver los extremos de cada variable del diseño. Una vez con los resultados, vamos a proceder a evaluarlos. Existen diferentes maneras de evaluarlos, por ejemplo mediante análisis de la varianza (ANOVA), pero una de las maneras más intuitivas de interpretar estos diseños es mediante diagramas de Pareto, en los que se se indica mediante barras la influencia y el signo de la interacción de cada una de las variables. Además, en los diagramas de Pareto estandarizados, se puede saber qué variables son estadísticamente significativas. Para estimar los errores estadísticos hay que hacer repeticiones en algún punto del diseño, en este caso en el centro del diseño. Veamos el diagrama de Pareto estandarizado para el factor de retención del R-ketoprofeno (R-KPF):

Diagrama de Pareto estandarizado

Se observa que, de todos los factores estudiados, únicamente el pH y el porcentaje de 2-PrOH son significativos al sobrepasar la línea vertical que muestra la variabilidad estadística. Las otras dos variables (Tampón y TEA) así como las interacciones entre las variables no son significativas. Además indica que ambas variables significativas tienen influencia negativa sobre la respuesta, es decir, que al aumentar el pH o el porcentaje de 2-PrOH disminuye k_R-KPF, es decir, se retiene menos.

Hay que destacar de igual manera que las únicas interacciones que aparecen son con el pH (A) ya que, al reducir el número de ensayos, hemos perdido esa información. En este caso, la interacción AB se confunde con la CD, la AC con la BD y la AD con la BC.

Una vez definidas las dos variables más importantes, procedí a optimizarlas mediante un diseño factorial completo de superficie de respuesta, es decir, utilicé un diseño factorial completo (sin fraccionar) en el que cada dimensión tenía más de dos puntos, pudiendo ajustarlos a una curva para modelizar los cambios. Para ello utilicé este diseño 3²:

Matriz del diseño factorial completo

En este diseño tampoco se obtuvo ninguna interacción significativa, siendo en la mayoría de los casos únicamente los factores principales como significativos (lo puedes comprobar en los diagramas de Pareto). A partir de estos datos, se realizó una superficie de respuesta para cada respuesta (valga la redundancia), obteniéndose 7 puntos óptimos...

¿Y ahora qué? ¿Cuál de todas es la óptima total? ¿Importan igual todas las respuestas? En este caso se llevó a cabo una optimización multi-respuesta, en la que algunas de las respuestas se obviaron o se ponderaron para dar lugar a un único valor, la deseabilidad. Es esta función la que haremos única para cada punto de la matriz, teniendo, finalmente, una solución por punto y representando la superficie de respuesta obtenida con su ecuación.

Función de deseabilidad

En esta función de deseabilidad, el punto máximo (o mínimo) sería el valor óptimo general aunque no sea el particular de alguna respuesta. Estas superficies de respuesta pueden ser de más de dos dimensiones, resultando las mallas de respuesta, en las que hay más de dos variables y su representación es tridimensional.

Malla de respuesta para la extracción del gel Extraplús

Todos estos resultados han sido obtenidos con el software Statgraphics Centurion XVI. Este software tiene un asistente para el diseño de experimentos que te guía a través de todos los pasos para realizar tu diseño. Lo puedes descargar y probar gratis durante 30 días aquí. Para más teoría recomiendo el libro "Análisis y diseño de experimentos" de Humberto Gutiérrez Pulido y Román de la Vara Salazar. Si no lo encontráis en la biblioteca, es posible encontrarlo en buena calidad por la red (🏝🛳, jou jou).

Hasta aquí el tema de hoy, escogido por la encuesta de Facebook. Como siempre digo, si tienes dudas, quieres comentarios más a fondo o cualquier duda puedes preguntarlo en los comentarios de abajo. También me puedes pedir la tesis completa donde está más explicado y tienes el contexto completo de estos diseños.

Nos vemos la semana que viene!
Cuídate!!

Tutorial Blender 1: Cómo hacer un matraz erlenmeyer

Hoy traigo algo diferente, Blender, un programa para modelar en 3D que os servirá para muchas cosas, desde crear modelos estáticos de cosas que os gusten, hacer animaciones, crear juegos, simular fluidos, tejidos, etc. Por supuesto, sirve para modelar moléculas, proteínas y un montón de cosas que os puede servir para trabajos, tesis y más. Es un programa muy completo, gratuito y muy potente. Os lo podéis descargar de manera gratuita en la página oficial de Blender.

En el videotutorial de hoy  explico muy rápidamente cómo es Blender y haremos un matraz erlenmeyer de una manera rápida y fácil. Si quieres más tutoriales me lo puedes indicar en los comentarios⇩, en Facebook o en Youtube 👍. Antes de nada, pido disculpas por el audio. El micro que tengo no es muy bueno, trabajaré en ello. A lo largo de la semana intentaré poner subtitulos por si alguien los necesita.

Me despido por hoy sin olvidarme de darle el mérito de la música a No Mark!, un grupo muy bueno y prometedor. También tienen canal en Youtube donde suben los videoclips de sus temazos, algunos muy currados. Échale un ojo y no te arrepentirás.

Nos vemos pronto!!

Cuídate!!

PD: Para aquellos que quieran saber más (por si no hay más tutoriales) pueden seguir el Canal Blender o a Blender Guru (en inglés), más recomendado éste ultimo. En ambos hay tutoriales desde cero.

¿Cómo funciona la cromatografía?

En el post de la semana pasada vimos qué era y para qué servía la cromatografía, esta semana vamos a intentar entender cómo funciona. Empezamos!!

¿Qué es un proceso de distribución?

La semana pasada vimos, en el ejemplo del profesor Luis Polo, que los bañistas se distribuían entre los locales y el río, pero ¿eso cómo funciona?

Si seguimos con ejemplos de casa, sabrás que el agua y el aceite no se mezclan. Si añadimos un poquito de colorante alimentario podrás ver que parte se queda en el aceite y parte en el agua. El colorante se ha distribuido entre las dos fases. Así de simple. 

• ¿Todos los colorantes se distribuyen igual? La respuesta es no, ni siquiera todos los colorantes del mismo color.
• Y si añado más del mismo colorante, ¿qué pasa? Pues que la relación entre la cantidad (concentración) de colorante entre las dos fases es constante. Esto expresado matemáticamente:

K = C_agua/C_aceite

donde C_agua es la concentración del colorante en el agua, C_aceite es la concentración del colorante en el aceite y K es la constante de distribución.

Este proceso de distribución se lleva a cabo de la misma manera entre las fases estacionarias y móvil en la cromatografía. Como cada sustancia tiene distinta K entre las dos fases somos capaces de separarlos por muy similares que sean. Únicamente seremos incapaces cuando sean exactamente iguales.

Separaciones utilizando procesos de distribución

Hemos comentado que la relación entre la concentración en ambas fases es constante, por lo que si, por ejemplo, añadimos más agua, parte del colorante en el aceite pasará al agua para mantener la distribución constante. Es decir, hemos extraído colorante del aceite y lo hemos pasado al agua.

Ahora, empleando un embudo de decantación, vamos a separar el agua y el aceite, por lo que tendremos el colorante distribuido en dos vasos. Añadimos más agua al aceite separado para seguir extrayendo más colorante, agitamos, dejamos que se distribuya y volvemos a extraer. Esta segunda porción de agua tiene menos colorante, pero todavía tiene, por lo que seguimos extrayendo hasta que el agua y el aceite despues de separar no tenga nada de colorante. Al final, ¿cuántas extraciones hemos realizado? 10, 100, 1000... Muchas, en cualquier caso, y hemos utilizado mucha agua para extraer el colorante, varios litros. Este es el fundamento de las extracciones líquido-líquido. También podemos retener el colorante en vez de en un líquido en un sólido, como las toallitas esas que se añaden a la lavadora para evitar que se nos destiña toda la colada. En el caso de querer extraer el colorante de la toallita, estaríamos hablando de una extracción sólido-líquido.

Para pasar de este tipo de extracciones a la cromatografía únicamente habría que dejar fija la toallita. Vimos, en el ejemplo de los rotuladores del post anterior, que los colorantes estaban fijos en un punto y, por distribución entre el papel y el disolvente que subía, se iban separando. En este caso, en cada instante y en cada punto del papel se estaba llevando a cabo una distribución. La parte que se quedaba en el papel no avanzaba mientras que la parte en el disolvente seguía subiendo y modificando constantemente las relación de concentraciones. Como las K de cada componente de la tinta son diferentes somos capaces de separarlos (lo que hace la cromatografía, por si no había quedado todavía claro 😜).

¿Y cómo calcular cuánto se retiene cada cosa?

El calcular las concentraciones de cada especie en un proceso dinámico es bastante complicado, por eso se han buscado otros parámetros para medirlo indirectamente.

• En el caso de que se lleve a cabo en papel o similares (como en el caso de los rotuladores) se utiliza el factor de retención (retention factor en inglés, R_f)

R_f = d_compuesto/d_disolvente

Medida de Rf

En el caso de la figura, los puntos rojos corresponden al mismo compuesto ya que tienen el mismo R_f mientras que, en el caso de los puntos azules, aunque son muy similare son compuestos diferentes. El compuesto negro no corresponde a ningun otro cumpuesto presente.

• En el caso de que se lleve a cabo en una columna (como en la figura de la semana pasada), se mide el factor de retención (k). Se utiliza este factor ya que es aproximadamente constante para cada compuesto si se utilizan las mismas condiciones independientemente del equipo utilizado.

k = (t_R-t₀)/t₀

donde t_R es el tiempo de retención del compuesto (lo que tarda en salir de la columna desde que entra) y t₀ (tiempo básico, no muerto, como pone en muchos libros, nadie se mueren con esto) es el tiempo de retención de un compuesto no retenido (o del disolvente de la muestra). El valor de k no debe ser inferior a 2 (ya que apenas se retendría lo suficiente para separarse del disolvente) ni superior a 10, ya que se retendría demasiado y se "desparramaría" por toda la columna. Valores hasta k = 20 son aceptables únicamente en cromatografías con interacciones muy grandes o separaciones muy pequeñas (cromatografía iónica o quiral, ya hablaremos de ellas otro día).

Por hoy es suficiente. Espero que hayas comprendido lo que es una distribución y su empleo en la cromatografía. También, la relación de la distribución y la retención (lo que se queda en la fase estacionaria se retiene con respecto al resto. Espero sacar otro post para el jueves. Decide qué tema tratar en la encuesta de arriba a la derecha (es posible que sólo se vea en la vista de la página web y no en versión móvil, se puede cambiar abajo) y suscribíos para estar a la última!

Cuidaos y nos vemos en el próximo post!

¿Qué es eso de la "cromatografía"?

Hoy te introduciré por encima el mundo de la cromatografía, es decir, a la parte principal de mi tesis doctoral. Una introducción para todos los públicos. Ya habrá tiempo para profundizar con calma. Empecemos:

¿Qué es la cromatografía?

Según la Real Academia Española la cromatografía es un método de análisis químico para la separación de los componentes de una mezcla por distribución entre dos fases, una estacionaria y otra móvil. Esta definición es adecuada para que nos hagamos una idea aunque no es del todo correcta.

La idea general es que sirve para separar mezclas (si no hay mezclas no hay nada que separar), y esa es la idea principal con la que hay que quedarse. Con la cromatografía separamos, no medimos, no cuantificamos y no sabemos cuánto de bien lo separamos. Para saber todo esto necesitamos una técnica complementaria que mida después de separar.

Segunda idea: Distribución entre dos fases, una estacionaria y otra móvil. Es decir, tenemos una fase estacionaria (fija) donde se van a retener los componentes de la mezcla mientras que los demás son arrastrados. Los que más interaccionen con la fase se retendrán más mientras que los que interaccionen poco serán fácilmente arrastrados por la fase móvil. Por tanto, se va a llevar a cabo la distribución de las moléculas entre una fracción retenida en la fase estacionaria y el resto en la fase móvil. Por próximas que sean estas fracciones entre dos moléculas diferentes esta técnica es capaz de separarlas mediante un elevadísimo número de repeticiones, pero en este tema entraremos más a fondo próximamente.

No me resisto a poner el ejemplo que me dio mi director de tesis Luis Polo hace ya bastantes años: 

Un símil de la cromatografía es un río en el que se lanza a la vez a un montón de gente con chalecos salvavidas. Este río es especial y en su orilla hay un bar y un cine. Ya que el tiempo medio que pasa una persona en un bar es distinto al que pasa en un cine es diferente (se puede hacer un símil con la interacción) podemos separar a la gente en 4 grupos dependiendo de lo que tarden en llegar al final del río: Grupo 1: los viejunos, no les gusta ni el bar ni el cine y prefieren dejarse arrastrar por la corriente. Grupo 2: los seres oscuros, no les gusta la luz del sol por lo que encuentran en el cine su escondite perfecto. Grupo 3: los juerguistas, les gustan los bares y espacios abiertos (y no tienen ganas de ir al cine a aguantar casi dos horas sentados y sin una mísera cervecita). Grupo 4: los ricos, les sobra el dinero (y al parecer el tiempo) y van ambos sitios, bar y cine. Estos cuatro grupos son arrastrados (y separados) por una fase móvil (el agua) dependiendo de su interacción con la fase estacionaria (bar + cine).

Recuerda que el río no cuenta gente, hay que poner a un becario al final para que cuente gente y que no están todos juntos en el cine o en el agua, realmente entran y salen continuamente.

Por tanto, la Real Academia Española da una definición genérica de la cromatografía pero falla, por ejemplo, en denominar método a la cromatografía cuando es una técnica. Cosas de frikis, vamos.

Una definición mucho más adecuada la ofrece la IUPAC en su libro dorado, que define a la cromatografía como un método físico de separación en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras que la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección definida. Esta definición es muy similar pero hace hincapié en que la fase móvil debe moverse en una dirección definida (como en un río) y no puede estar yendo y viniendo (como en una lavadora). También destaca la diferencia de método físico y químico. Realmente es un método físico, ya que las interacciones no modifican la naturaleza de la materia, aunque hay gente que lo considera como una reacción química, la reacción de retención, con todos sus parámetros fisicoquímicos perfectamente definidos.

¿Por qué cromatografía?

Etimológicamente, la palabra cromatografía proviene del griego chroma que quiere decir color y grafein que quiere decir escritura. Entonces, que narices tiene que ver el escribir con colores con el rollo del río?!?! Calma, todo tiene explicación. Todo proviene de que los primeros experimentos realizados por el botánico M.S. Tsweet a principios de siglo con hojas de plantas en los que los componentes se iban separando a través de una columna rellena de partículas de sílice y arrastradas por disolventes orgánicos. Estos disolventes extraían los componentes coloreados de las hojas y los separaba, creando patrones de colores que servían para identificar el tipo de planta. Actualmente, casi todo lo que se analiza es transparente y el nombre de la técnica ha quedado únicamente como recuerdo de cómo empezó todo.

Separación de pigmentos de plantas
(https://www.cromatografialiquida.com.br/Imagens/Colunaespinafre.jpg)

¿Yo puedo separar cosas en casa?

Hay un experimento muy fácil en el que puedes intentar separar los componentes presentes en las tintas de los bolígrafos.

(Empieza a cantar la canción de Bricomanía o de Art Attack o de algo de ese tipo que te motive. En algunos casos el hablar con acento vasco ayuda, jajaja)

Para empezar necesitamos:

• Una mezcla (es decir, los bolis). Si son de distinto color mucho mejor.
• Una fase estacionaria, en nuestro caso, un trozo de folio.
• Una fase móvil. Podéis elegir entre alcohol de botiquín (96%) o acetona (presente en muchos quitaesmalte de uñas).
• Un lapiz, para marcar donde empezamos a arrastrar.

Ahora sólo falta un sitio donde mantener el folio vertical. En los laboratorios se utiliza un utensilio de última tecnología para ello, un tarro de mermelada. Última tecnología. Si queréis algo menos sofisticado, podéis conseguirlo con un vaso del que sobresalga  el folio y enrollarlo al lápiz, apoyado sobre el vaso, por ejemplo.

Ahora que tenemos lo más importante hay que cortar el folio para que entre en el vaso o el tarro estando recto. Una vez cortado, a un dedo y medio del borde hay que hacer una línea con el lápiz y, en esta línea distribuir lo mas homogéneamente posible todos los bolis.

Una vez preparada la fase estacionaria se pone un dedo de fase móvil en el soporte y se introduce el folio manteniendo la línea de lapiz paralela a la superficie del disolvente, evitando que la línea del lápiz se sumerja. Si toca la balsa de disolvente no vale, toca volver a empezar.

Si lo dejas reposar, el disolvente irá ascendiendo lentamente por el folio arrastrando con diferente fuerza a cada uno de los componentes de la tinta, separándolos.

Este mismo efecto lo habéis visto cuando se os mojaba la mochila y se corría toda la tinta de los libros y los cuadernos, el principio fisicoquímico es el mismo. Si quieres ampliar puedes probar diferentes disolventes (disolvente de pintura, gasolina o agua) o pintar dos veces con el mismo boli en el mismo papel para ver que se separan igual. Si te fijas, en la figura se ve como el rotulador rojo y el negro comparten los componentes magenta y amarillo, se diferencian principalmente en que el negro lleva algo de verde.

Separación de pigmentos de rotulador
(https://www.webinnate.co.uk/science/images/ch04.jpg)

Por hoy ya ha sido bastante el rollo, la semana que viene más y mejor. Espero que hayas entendido todo, si no es así aquí abajo⇩ están los comentarios, donde preguntar si hay dudas. Esta semana podéis proponer tema para el lunes (comentarios o encuesta) que viene ya que dentro de dos post seguiremos ampliando estas separaciones. Espero que, al menos, haya quedado claro que en mi tesis me he dedicado a separar cosas, jajaja.

Cuídate y nos vemos la semana que viene!!